מידת טוהר החלבון הנדרשת תלויה בשימוש הסופי המיועד של החלבון.
עבור יישומים מסוימים, תמצית גס מספיק. עם זאת, עבור שימושים אחרים, כגון מזון ותרופות, רמה גבוהה של טוהר נדרש. כדי להשיג זאת מספר שיטות טיהור חלבון משמשים בדרך כלל, בסדרה של שלבי טיהור.
כל צעד טיהור חלבון בדרך כלל תוצאות במידה מסוימת של אובדן המוצר. לכן, אסטרטגיית טיהור חלבון אידיאלי הוא אחד שבו הרמה הגבוהה ביותר של טיהור הוא הגיע הצעדים המעטים ביותר. הבחירה של אילו צעדים להשתמש תלויה בגודל, תשלום, מסיסות ומאפיינים אחרים של חלבון המטרה. הטכניקות הבאות הן המתאימות ביותר לטיהור חלבון cytosolic יחיד. טיהור של מתחמי חלבון cytosolic הוא מסובך יותר ובדרך כלל דורש כי שיטות שונות להיות מיושם.
צעדים ראשונים לטיהור חלבון
הצעד הראשון טיהור תאיים (בתוך התא) חלבונים הוא הכנת תמצית גסה .
תמצית יכיל תערובת מורכבת של כל החלבונים מן הציטופלסמה התא, וכמה מקרומולקולות נוספות, cofactors, וחומרים מזינים. תמצית הגולמי עשוי לשמש עבור יישומים מסוימים ביוטכנולוגיה, עם זאת, אם טוהר הוא בעיה, הצעדים הבאים טיהור חייב להיות מלווה.
תמציות חלבון גולמי מוכנים על ידי הסרת פסולת הסלולר שנוצר על ידי תמוגה התא, אשר מושגת באמצעות כימיקלים ואנזימים , sonication או צרפתית Press. הפסולת מוסרת על ידי צנטריפוגה, ואת supernatant הוא התאושש. ההכנות הגולמי של חלבונים תאיים ניתן להשיג פשוט על ידי הסרת תאים על ידי צנטריפוגה.
עבור יישומים מסוימים ביוטכנולוגיה , יש ביקוש אנזימים thermostable : אנזימים שיכולים לסבול טמפרטורות גבוהות ללא denaturing, תוך שמירה על פעילות ספציפית גבוהה. אורגניזמים שמייצרים אותם נקראים לפעמים "קיצוניים". גישה קלה לטיהור חלבון עמיד בחום היא לשלול את החלבונים האחרים בתערובת על ידי חימום, ולאחר מכן קירור הפתרון (ובכך מאפשר האנזים תרמוסטאבל כדי רפורמה או redissolve, אם יש צורך.החלבונים מפוגל ניתן להסיר מכן על ידי צנטריפוגה.
טיהור ביניים צעדים
בעבר, צעד שני משותף לטיהור חלבון מתמצית גולמית היה על ידי משקעים בפתרון בעל חוזק אוסמוטי גבוה (כלומר, תמיסות מלח). חומצות גרעין בתמצית הגולמי ניתן להסיר על ידי אגרגטים מזרז נוצר עם סטרפטומיצין גופרתי או פרוטאמין גופרתי.
משקעים חלבונים נעשה בדרך כלל באמצעות אמוניום סולפט כמו מלח.
חלבונים שונים יזרזו בריכוזים שונים של אמוניום סולפט . באופן כללי, חלבונים בעלי משקל מולקולרי גבוה ממהרים בריכוז נמוך יותר של אמוניום סולפט. משקעים מלח אינו מוביל בדרך כלל חלבון מטוהרים מאוד, אבל יכול לסייע בחיסול כמה חלבונים לא רצויים בתערובת וריכוז המדגם. מלחים בתמיסה מוסרים על ידי דיאליזה באמצעות צינורות תאית נקבובית, סינון, או כרומטוגרפיה ג'ל אי הכללה.
פרוטוקולי ביוטכנולוגיה מודרניים לעיתים קרובות לנצל את ערכות רבות זמין מסחרית המספקים פתרונות מוכנות עבור נהלים סטנדרטיים. טיהור חלבון מבוצע לעיתים קרובות באמצעות מסננים ועמודות סינון מוכן ג'ל. כל מה שאתה צריך לעשות הוא למלא את ההוראות ולהוסיף את הכרך הנכון של הפתרון הנכון ולחכות את אורך הזמן שצוין בעת איסוף eluant (מה יוצא הקצה השני של הטור) במבחנה טריים.
- שיטות כרומטוגרפיות ניתן ליישם באמצעות העמודה העליונה הספסל או ציוד אוטומטי HPLC. ההפרדה על ידי HPLC יכול להיעשות על ידי הפאזה הפוכה, יון חילופי או שיטות הרחקה גודל, ודגימות זוהה על ידי מערך דיודה או טכנולוגיית לייזר.
פרוטאינים ויזואליזציה והערכת טיהור
- שלב כרומטוגרפיה הפוכה (RPC) מפריד חלבונים על בסיס הידרופוביטיות היחסית שלהם. טכניקה זו היא סלקטיבית מאוד, אך דורש את השימוש של ממיסים אורגניים. חלבונים מסוימים הם denatured לצמיתות על ידי ממיסים יאבד פונקציונליות במהלך RPC. לכן שיטה זו אינה מומלצת לכל היישומים, במיוחד אם יש צורך בחלבון המטרה לשמור על פעילות.
- יון חילופי כרומטוגרפיה מתייחס ההפרדה של חלבונים מבוסס על תשלום . עמודות יכול להיות מוכן חילופי אניונים או חילופי קטיון. עמודות חילופי אניון מכילים שלב נייח עם מטען חיובי שמושך חלבונים טעונים שלילי. עמודות חילופי קטיון הן החרוזים הפוכים, טעונים שלילי, אשר מושכים חלבונים טעונים באופן חיובי. אלוטיון של חלבון המטרה (ים) נעשה על ידי שינוי ה- pH בעמודה, וכתוצאה מכך שינוי או נטרול של קבוצות תפקוד טעונות של כל חלבון.
- הכרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל ( סינון ג'ל ) מפרידה חלבונים גדולים יותר מאלה הקטנים, שכן המולקולות הגדולות יותר עוברות במהירות רבה יותר דרך הפולימר הצולב הצולב בעמודת הכרומטוגרפיה. החלבונים הגדולים אינם מתאימים לתוך הנקבוביות של הפולימר בעוד חלבונים קטנים לעשות, ולקחת יותר זמן לנסוע דרך עמוד כרומטוגרפיה, דרך המסלול פחות ישיר שלהם. Eluate נאסף בסדרה של צינורות המפרידים חלבונים על בסיס זמן elution. ג'ל סינון הוא כלי שימושי לריכוז מדגם חלבון מאז חלבון היעד נאסף נפח elution קטן יותר מאשר בתחילה הוסיף את הטור. טכניקות סינון דומה עשוי לשמש במהלך ייצור חלבון בקנה מידה גדול בגלל העלות שלהם יעילות.
- כרומטוגרפיה זיקה היא טכניקה שימושית מאוד עבור "ליטוש" או השלמת תהליך טיהור החלבון. חרוזים בעמודה כרומטוגרפיה הם cross-linked כדי ligands כי נקשרים ספציפית חלבון היעד. חלבון מוסר מכן מן הטור על ידי שטיפה עם פתרון המכיל ligands חינם. שיטה זו נותנת את התוצאות הטהורות ביותר ואת הפעילות הספציפית הגבוהה ביותר בהשוואה לטכניקות אחרות.
- SDS-PAGE הוא ג 'ל polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה, ביצע בנוכחות של SDS (נתרן dodecyl סולפט) אשר נקשר חלבונים נותן להם מטען שלילי נטו גדול. מאז האשמות של כל החלבונים שווים למדי, שיטה זו מפרידה אותם כמעט לחלוטין על פי גודל. SDS-PAGE משמש לעתים קרובות כדי לבדוק את טוהר החלבון לאחר כל צעד בסדרה. כמו חלבונים לא רצויים מוסרים בהדרגה מן התערובת, מספר להקות דמיינו על ג'ל SDS-PAGE מצטמצם, עד שיש רק הלהקה המייצגת את החלבון הרצוי.
- Immunoblotting היא טכניקה להדמיה חלבון להחיל בשילוב עם כרומטוגרפיה זיקה. נוגדנים עבור חלבון מסוים משמשים ligands על עמודות כרומטוגרפיה זיקה. חלבון המטרה נשמר על העמודה, ולאחר מכן הוסרו על ידי שטיפת עמודה עם תמיסת מלח או סוכנים אחרים. נוגדנים הקשורים תוויות רדיואקטיביים או צבע לסייע באיתור של חלבון המטרה פעם זה מופרד משאר התערובת.
מקורות:
זובאי ג. 1988. ביוכימיה, מהדורה שנייה. מקמילן הוצאה לאור, ניו יורק, ניו יורק, ארה"ב.
Amermham Pharmacia ביוטק. 1999. Protein טיהור מדריך, מהדורה AB. Amersham Pharmacia ביוטק בע"מ ניו ג'רזי, ארה"ב. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.