התאמות לכל אחד מרכיבי התגובה של תגובת שרשרת פולימראז (PCR) יכולות לשנות את איכות התוצאה, בין אם על ידי שיפור או הפחתת תשואת המוצר ואיכותו או על ידי שיפור סגוליות התגובה ורגישותה. פרמטרים המשפיעים על התוצאה הסופית יכולים להיות פיזית (כלומר, טמפרטורה, זמני מחזור) או כימיים (כלומר, ריכוז תבנית, סוג האנזים המשמש). להלן מספר גורמים מרכזיים המשפיעים על הצלחת ה- PCR.
01 תנאי מעבדה נקיים
מאז PCR הוא מסוגל לזהות מולקולה אחת של ה- DNA, חשוב לשמור על תנאים וטהור במעבדה. תמיד ללבוש כפפות טריות, להשתמש כלי זכוכית סטרילי, צינורות טיפים פיפטה פתרונות סטריליים, לנקות את שטח העבודה לפני תחילת העבודה.
תמיד לכלול תגובות שליטה, ללא DNA תבנית ללא אנזים, כדי להבטיח את התוצאות הן באמת בשל הגברה של המדגם הנכון.
רוב האנשים לוודא שיש קבוצה משלהם של פתרונות שאינם משותפים כדי להפוך את פתרון בעיות קל יותר וטפטפות המיועדים לעתים קרובות להפריש רק עבור PCR. DNase ו- RNase ללא צינורות PCR, תרסיס עמיד פיפטה טיפים ועבודה ברדס קטר עם אור UV גם דרכים למזער בעיות.
02 מרכיבים כימיים
- יש 18 עד 24 בסיסים
- אין מבנה משני (כלומר, סיכות ראש)
- יש הפצה מאוזנת של G / C ו- A / T זוגות
- הם אינם משלימים זה את זה על הקצוות 3 מטר
- יש טמפרטורות ההיתוך (Tm) על 5-10 מעלות צלזיוס מתחת לטמפרטורת חישול, אשר בדרך כלל בין 55 ל 65 מעלות צלזיוס
TM עבור שני primers צריך להיות גם דומה לתוצאות הטובות ביותר.
03 מיקס תגובה: תבנית ופרימרים
ריכוזי פריימר אופטימליים הם בין 0.1 ו 0.6 מיקרומול / L. כמות התבנית משתנה בהתאם לסוג ה- DNA (אנושי, חיידקי, פלסמיד).
עם כמויות נמוכות מאוד של תבנית, יש אסטרטגיות אחרות כדי לשפר את התוצאות, כמו מספרי מחזור מוגברת או שימוש "התחלה חמה". תמיד לבדוק פריימרים חדשים עם תגובה שליטה חיובית, כדי להיות בטוח שהם עובדים תחת תנאי הניסוי הספציפי שלך.
04 מערבבים תגובה: פעילות האנזים
ריכוז MgCl2 בתמהיל התגובה יכול להשפיע על תוצאות ה- PCR ויכול לשחק תפקיד חשוב בתגובות קפדניות יותר. מגנזיום קטיון צורות קומפלקסים מסיסים עם dNTPs לייצר את המצע בפועל כי האנזים פולימראז מזהה.
כמויות שוות של כל ארבעת dNTPs גם לעזור להפחית את שיעור השגיאה polymerase. תוספים מסוימים כגון betaine, BSA, דטרגנטים, DMSO, גליצרול, ו pyrophosphatase יכול גם להשפיע על סגילות האנזים או יעילות התגובה.
05 סוג של Thermocycler
כאשר קונים ציוד מעבדה, יש לזכור כי כמה thermocyclers הם פחות מדויקים מאשר אחרים לשמור על טמפרטורות מדויקות, הרצוי.
זהו אזור אחד שבו הולך זול לא ישתלם בטווח הארוך כאשר אתה מתמודד עם תגובה מדובלל או באמצעות primers הדורשים טווח צר של חישול הטמפרטורה.
צינורות התגובה דק דופן תוכנן כדי להתאים את המותג המדויק של thermocycler אתה משתמש, גם לעזור לייעל טמפרטורות התגובה.
06 הגדרות מחזור
תשואה מוגברת יכולה להיות מושגת על ידי הגדלת זמן ההרחבה על כל 20 מחזורים, כדי לפצות על פחות אנזים כדי להגביר את התבנית יותר. בדרך כלל, פחות מ -40 מחזורים מספיק כדי להגביר פחות מ 10 מולקולות תבנית לריכוז גדול מספיק כדי להציג על אתרידיום ברומיד מוכתם agarose ג'ל .