שיבוט גנטי הוא מעשה הכנת עותקים, או שיבוטים, של גן אחד. לאחר זיהוי הגן, שיבוטים יכולים לשמש בתחומים רבים של מחקר ביו-רפואי ותעשייתי. הנדסה גנטית היא תהליך של שיבוט גנים לאורגניזמים חדשים או שינוי רצף ה- DNA כדי לשנות את המוצר חלבון. ההנדסה הגנטית תלויה ביכולתנו לבצע את ההליכים החיוניים הבאים.
תגובות שרשרת פולימראז
הגבלת אנזימים
גילוי של אנזימים הידועים בשם הגבלת האנדוקלאס היה חיוני להנדסת חלבונים . אנזימים אלה חותכים DNA במקומות ספציפיים בהתבסס על רצף נוקליאוטידים. מאות אנזימי הגבלה שונים, המסוגלים לגזור DNA במקום נפרד, היו מנותקים מזנים שונים של חיידקים. DNA לחתוך עם אנזים הגבלה מייצרת שברי קטן בהרבה, בגדלים שונים. אלה יכולים להיות מופרדים באמצעות ג'ל אלקטרופורזה או כרומטוגרפיה.
03 אלקטרופורזה
טיהור דנ"א מתרבות תאים, או גזירתו באמצעות אנזימי הגבלה, לא יועילו במידה רבה אם לא נצליח לדמיין את ה- DNA - כלומר, למצוא דרך לראות האם התמצית שלך מכילה משהו או מה גודל השברים שלך חתכתי אותו. אחת הדרכים לעשות זאת היא באמצעות ג'ל אלקטרופורזה. ג'ל משמשים למגוון מטרות, החל צפייה DNA לחתוך לאיתור מוסיף DNA ו knockouts.
04 הצטרפות שני חלקים של DNA
במחקרים גנטיים, לעתים קרובות יש צורך לקשר שני גדילים בודדים או יותר של DNA, ליצור גדיל רקומביננטי, או לסגור גדיל מעגלי שנחתך עם אנזימי הגבלה. אנזימים הנקראים ליגזי דנ"א יכולים ליצור קשרים קוולנטיים בין שרשראות נוקליאוטידים. פולימראז DNA אנזימים אני ו polinucleotide קינאז חשובים גם בתהליך זה, עבור מילוי פערים או phosphorylating את הקצוות 5 ', בהתאמה.
05 מבחר קטן DNA משכפל עצמי
חלקים קטנים של דנ"א שאינם חלק מגנום חיידקי, אך מסוגלים לשכפל את עצמם, ידועים כפלסמידים. פלסמידים משמשים לעתים קרובות כווקטורים להעברת גנים בין מיקרואורגניזמים. בביוטכנולוגיה, כאשר הגן של עניין כבר מוגבר ואת הגן ופלסמיד נחתכים על ידי אנזימים הגבלה, הם ligated יחד לייצר מה שמכונה DNA רקומביננטי. דנ"א נגיפי (bacteriophage) יכול לשמש גם כקטור, כמו קוסמטיים, פלסמידים רקומביננטי המכיל גנים bacteriophage.
06 שיטה להעביר וקטור לתוך תא מארח
תהליך העברת החומר הגנטי על וקטור כמו פלסמיד, לתוך תאים חדשים המארח, נקרא טרנספורמציה. טכניקה זו דורשת כי תאים המארח נחשפים לשינוי סביבתי שהופך אותם "מוכשר" או חדיר באופן זמני את וקטור. Electroporation היא טכניקה אחת כזו. ככל פלסמיד, התחתון את היעילות שבה הוא נלקח על ידי תאים. מקטעי DNA גדולים יותר משוכפלים בקלות יותר באמצעות חיידקים, רטרווירוס או וקטורים ויראליים אחרים או קוסמיקות בשיטה הנקראת התמרה. Phage או וקטורים ויראליים משמשים לעתים קרובות ברפואה רגנרטיבית, אך עלולים לגרום להחדרת DNA בחלקים של הכרומוזומים שלנו, שם אנחנו לא רוצים את זה, גורם לסיבוכים ואף לסרטן.
שיטות לבחירת אורגניזמים טרנסגניים
לא כל התאים ייקחו DNA במהלך השינוי. זה חיוני כי תהיה שיטה של גילוי אלה לעשות. בדרך כלל, פלסמידים לשאת גנים עבור עמידות אנטיביוטיקה תאים מהונדס ניתן לבחור על בסיס ביטוי של גנים אלה ואת יכולתם לגדול על מדיה המכילה אנטיביוטיקה. שיטות חלופיות של בחירה תלויה בנוכחות של חלבונים אחרים כתב כגון מערכת x-gal / lacZ , או חלבון הקרינה הירוקה, אשר מאפשרים בחירה המבוססת על צבע פלואורסצנטי, בהתאמה.