מה PCR יש לעשות עם רצף דנ"א הגברה הגנים
תגובת שרשרת הפולימראז ( PCR ) היא טכניקה גנטית מולקולארית ליצירת עותקים מרובים של גן, והיא גם חלק מתהליך סידור הגנים.
כיצד פועל פולימרז שרשרת התגובה?
עותקים גנטיים נעשים באמצעות מדגם של DNA, והטכנולוגיה טובה מספיק כדי ליצור עותקים מרובים מעותק יחיד של הגן שנמצא במדגם. PCR הגברה של הגן לעשות מיליוני עותקים, מאפשר זיהוי וזיהוי רצפי גנים באמצעות טכניקות ויזואליות המבוססות על גודל תשלום (+ או -) של פיסת ה- DNA.
תחת תנאים מבוקרים, קטעים קטנים של דנ"א נוצרים על ידי אנזימים הידועים בשם פולימרים דנ"א, שמוסיפים deoxynucleotides חינם (dNTPs) לפיסת DNA המכונה "תבנית". אפילו חתיכות קטנות יותר של DNA, הנקראות "primers" משמשות כנקודת מוצא עבור הפולימראז. פריימרס הם קטנים מעשה ידי אדם חתיכות של DNA (אוליגומרים), בדרך כלל בין 15 ל 30 נוקליאוטידים ארוך. הם נעשים על ידי ידיעה או ניחוש רצפי דנ"א קצרים על הקצוות של הגן להיות מוגבר. במהלך PCR, ה- DNA להיות רצף מחומם ואת הגדילים כפולים נפרדים. על קירור, primers לאגד את התבנית (הנקראת חישול) וליצור מקום פולימראז להתחיל.
טכניקת ה- PCR
תגובת שרשרת הפולימרז (PCR) התאפשרה על ידי גילוי של thermophiles ואנזימים פולימראז thermophilic (אנזימים כי לשמור על השלמות המבנית ופונקציונליות לאחר חימום בטמפרטורות גבוהות).
השלבים המעורבים בטכניקת ה- PCR הם כדלקמן:
- תערובת נוצר, עם ריכוזים אופטימיזציה של תבנית ה- DNA, אנזים פולימראז, primers, ו dNTPs. היכולת לחמם את התערובת מבלי denaturing האנזים מאפשר denaturing של הסליל הכפול של דגימת DNA בטמפרטורות בטווח של 94 מעלות צלזיוס.
- לאחר denaturation, המדגם הוא מקורר לטווח מתון יותר, סביב 54 מעלות, אשר מאפשר את חישול (מחייב) של primers על תבניות DNA חד גדילי.
- בשלב השלישי של מחזור, המדגם הוא מחומם ל 72 מעלות, הטמפרטורה האידיאלית עבור פולימרז טאק DNA, להארכה. במהלך התארכות, פולימראז DNA משתמש בגדיל יחיד המקורי של ה- DNA כתבנית להוסיף dNTPs משלימים את הקצוות 3 'של כל פריימר וליצור קטע של DNA כפול תקועים באזור של הגן של עניין.
- פריימרס כי יש annealed כדי רצפי DNA שאינם בהתאמה מדויקת לא נשארים annealed ב 72 מעלות, ובכך להגביל התארכות אל הגן של עניין.
תהליך זה של denaturing, חישול הארכה חוזרים מרובים (30-40) פעמים, ובכך להגדיל באופן אקספוננציאלי את מספר העותקים של הגן הרצוי בתערובת. למרות תהליך זה יהיה די מייגע אם מבוצעת באופן ידני, דגימות ניתן להכין מודגרת ב programocable Thermocycler, שכיח עכשיו ברוב המעבדות המולקולריות, ואת התגובה מלאה PCR יכול להתבצע 3-4 שעות.
כל צעד denaturing מפסיק את תהליך התארכות של המחזור הקודם, ובכך לחתוך את החוט החדש של DNA ולשמור אותו לגודל של הגן הרצוי.
משך מחזור הארכה יכול להיעשות ארוך או קצר יותר בהתאם לגודל של הגן של עניין, אבל בסופו של דבר, באמצעות מחזורי חוזרות ונשנות של PCR, רוב התבניות יהיו מוגבלים לגודל של הגן של עניין לבד, כפי שהם ייווצרו ממוצרים של שני פריימרים.
ישנם מספר גורמים שונים עבור PCR מוצלח כי ניתן לטפל כדי לשפר את התוצאות. השיטה הנפוצה ביותר לבדיקת נוכחות של מוצר PCR הוא agarose ג'ל אלקטרופורזה . אשר משמש להפריד שברי דנ"א על בסיס גודל תשלום. את השברים הם דמיינו אז באמצעות צבעים או רדיזוטופים.
האבולוציה
מאז גילוי PCR, פולימרים DNA מלבד טאק המקורי התגלו. כמה מהם יש יכולת "הגהה" טוב יותר או יציבים יותר בטמפרטורות גבוהות יותר, ובכך לשפר את הספציפיות של PCR והקטנת טעויות מן ההכנסה של dNTP שגוי.
כמה וריאציות של PCR תוכננו עבור יישומים ספציפיים נמצאים כעת בשימוש קבוע במעבדות גנטיות מולקולריות. כמה מהם בזמן אמת PCR ו- Reverse Transcriptase PCR. גילוי PCR יש גם להוביל לפיתוח של רצף DNA , DNA טביעת אצבע וטכניקות מולקולריות אחרות.